EDG-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401366-ACT

S1PR3 (EDG-3) é um receptor acoplado à proteína G para o lípido bioativo esfingosina-1-fosfato (S1P), que se acopla às vias de sinalização Gαi, Gαq e Gα12/13 para regular o fluxo intracelular de cálcio, a atividade de GTPases da família Rho e a dinâmica da via MAPK/ERK. Por meio dessas cascatas, o EDG-3 influencia a função de barreira endotelial, o tônus vascular, o tráfego de leucócitos e programas inflamatórios responsivos a citocinas. A atividade de S1PR3 integra o metabolismo de esfingolípidos com processos de migração e adesão centrais para a regulação imunitária e a remodelação tecidual. A desregulação da sinalização de S1PR3 tem sido implicada em contextos inflamatórios e fibróticos e é frequentemente investigada em estudos de biologia vascular, neuroinflamação e microambiente tumoral.

EDG-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de S1PR3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EDG-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus S1PR3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição S1PR3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EDG-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus S1PR3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EDG-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EDG-3 em células tumorais com expressão de S1PR3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.