DNA pol δ 4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-408268-ACT-2

O POLD4 humano codifica a subunidade 4 da DNA polimerase delta (Pol δ4), um componente acessório do holoenzima Pol δ que sustenta a síntese de DNA da fita retardatária com alta fidelidade durante a replicação e também contribui para a síntese de reparo do DNA. Como parte da maquinaria de replicação, o POLD4 atua em vias centrais que regulam a progressão da forquilha de replicação, o processamento dos fragmentos de Okazaki e os checkpoints de estabilidade genômica, coordenando-se com a atividade polimerásica dependente de PCNA. Alterações no equilíbrio entre subunidades da Pol δ ou estresse replicativo envolvendo o POLD4 têm sido associados a aumento da carga mutacional e instabilidade cromossômica, características frequentemente observadas no câncer e em outros distúrbios de manutenção do genoma. A edição gênica direcionada ao POLD4 e ensaios funcionais permitem estudar a montagem do complexo polimerase, a escolha entre vias de replicação e reparo e as consequências celulares de uma fidelidade de síntese de DNA comprometida em sistemas modelo humanos.

DNA pol δ 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLD4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol δ 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLD4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLD4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol δ 4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLD4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol δ 4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol δ 4 em células tumorais com expressão de POLD4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.