DNA pol β Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402861-ACT

POLB codifica a DNA polimerase beta (DNA pol β), uma enzima-chave da via de reparo por excisão de bases (BER) que preenche lacunas de um único nucleotídeo e participa do reparo de “short patch” após a remoção de bases danificadas. A DNA pol β atua em locais de dano oxidativo e por alquilação, coordenando-se com XRCC1, a DNA ligase III e a APE1 para manter a estabilidade do genoma durante a replicação e em células não proliferativas. Alterações na expressão ou na atividade de POLB têm sido associadas a maior carga mutacional, instabilidade cromossômica e respostas aberrantes a danos no DNA observadas em diversos tipos de câncer e em modelos de doenças neurodegenerativas. Como um fator central do BER, POLB é frequentemente estudado no contexto da sinalização de estresse genotóxico, do reparo associado à replicação e de mecanismos de resistência a agentes que causam dano ao DNA em sistemas celulares.

DNA pol β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol β. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol β no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol β em células tumorais com expressão de POLB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.