Plásmido CRISPR de Activación (h) DNA-PK_CS: sc-400337-ACT

PRKDC codifica la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (DNA-PKCS), un regulador central de la respuesta al daño del ADN que acopla el reconocimiento de los extremos del ADN con su reparación. DNA-PKCS forma el holoenzima DNA-PK junto con el heterodímero Ku70/Ku80 para coordinar la unión de extremos no homólogos (NHEJ), promoviendo la reparación de roturas de doble cadena, la recombinación V(D)J y el mantenimiento de la estabilidad genómica. Mediante la fosforilación de sí misma y de múltiples factores de reparación y señalización, DNA-PKCS se integra con la señalización de ATM/ATR, las respuestas al estrés replicativo y la remodelación de la cromatina. La actividad o expresión desregulada de PRKDC se ha vinculado con cambios en la radiosensibilidad, fenotipos de inmunodeficiencia y la inestabilidad genómica observada en diversos contextos de investigación en cáncer y neurodegeneración.

DNA-PKCS El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PRKDC sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DNA-PKCS El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PRKDC en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PRKDC, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DNA-PKCS. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PRKDC y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DNA-PKCS en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DNA-PKCS en células tumorales con expresión de PRKDC silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.