Dkk-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420004-ACT

O gene Dkk1 de camundongo codifica a Dickkopf-1 (Dkk-1), um antagonista secretado da sinalização canônica Wnt/β-catenina que se liga a LRP5/6 e limita programas transcricionais induzidos por Wnt. Ao modular a atividade de Wnt, a Dkk-1 influencia o padrão embrionário, a diferenciação de osteoblastos e a homeostase óssea, além do remodelamento tecidual. A expressão alterada de Dkk1 está associada à desregulação da via Wnt observada em contextos como fenótipos esqueléticos, sinalização associada à fibrose e interações no microambiente tumoral, tornando-o um nó útil para a dissecação da via. A Dkk-1 também é estudada por seus efeitos sobre o comportamento de células-tronco/progenitoras e pelo crosstalk com redes inflamatórias e de fatores de crescimento.

Dkk-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Dkk1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dkk-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Dkk1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Dkk1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dkk-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Dkk1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dkk-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dkk-1 em células tumorais com expressão de Dkk1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.