DJ-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401006-ACT

O PARK7 humano codifica a DJ-1, uma proteína multifuncional responsiva ao estado redox que contribui para a defesa celular contra o estresse oxidativo e proteotóxico. A DJ-1 influencia a homeostase mitocondrial, o tamponamento de espécies reativas de oxigênio e a sinalização ativada por estresse, e tem sido associada à regulação de programas transcricionais e a atividades do tipo chaperona que dão suporte ao controle de qualidade de proteínas. Alterações na função de PARK7/DJ-1 estão associadas à neurodegeneração, particularmente à doença de Parkinson, e a fenótipos mais amplos de adaptação ao estresse em tecidos metabolicamente ativos. Como um nó que conecta respostas ao estresse oxidativo, dinâmica mitocondrial e homeostase proteica, a DJ-1 é amplamente estudada em modelos de vulnerabilidade neuronal e resiliência celular.

DJ-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PARK7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DJ-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PARK7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PARK7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DJ-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PARK7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DJ-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DJ-1 em células tumorais com expressão de PARK7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.