Dia 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401929-ACT

DIAPH1 (Dia 1) codifica uma formina relacionada à Diaphanous que regula a nucleação e o alongamento de filamentos de actina a jusante da sinalização por GTPases Rho. Dia 1 coordena o remodelamento do citoesqueleto necessário para a polaridade celular, adesão, citocinese e migração direcionada, e também contribui para a estabilização de microtúbulos por meio da comunicação cruzada actina–microtúbulo. Por meio desses processos, DIAPH1 influencia vias que governam a mecanotransdução e a dinâmica de membrana, incluindo a formação de filopódios e a montagem do anel contrátil. A atividade desregulada de DIAPH1 tem sido associada a fenótipos alterados de motilidade e divisão celular e, na literatura, está ligada a fenótipos do desenvolvimento e hematológicos/vasculares, sustentando sua relevância para estudos de mecanismos de doença.

Dia 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DIAPH1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dia 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DIAPH1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DIAPH1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dia 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DIAPH1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dia 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dia 1 em células tumorais com expressão de DIAPH1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.