DHODH Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402983-ACT

O DHODH humano codifica a diidroorotato desidrogenase, uma enzima flavina-dependente da membrana interna mitocondrial que catalisa a quarta etapa da biossíntese de novo de pirimidinas, oxidando diidroorotato a orotato e acoplando a transferência de elétrons à cadeia respiratória por meio da ubiquinona. Ao controlar a disponibilidade intracelular de nucleotídeos de pirimidina, o DHODH sustenta a síntese de DNA/RNA, a progressão do ciclo celular e a adaptação metabólica em condições proliferativas e de estresse. A atividade do DHODH se conecta ao balanço redox mitocondrial e a vias de homeostase de nucleotídeos que influenciam respostas ao estresse de replicação. O metabolismo de pirimidinas desregulado e o acoplamento bioenergético dependente de DHODH têm sido implicados na biologia de doenças proliferativas e na ativação de células imunes, tornando o DHODH um ponto mecanístico comum em estudos de vulnerabilidade metabólica.

DHODH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DHODH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DHODH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DHODH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DHODH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DHODH. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DHODH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DHODH no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DHODH em células tumorais com expressão de DHODH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.