Derlin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404762-ACT

DERL1 codifica Derlin-1, un componente di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) della macchina di degradazione associata al RE (ERAD) che facilita la retrotraslocazione di proteine luminali e di membrana mal ripiegate verso il turnover ubiquitina–proteasoma. Derlin-1 svolge una funzione nel controllo della proteostasi in condizioni basali e durante lo stress del RE, interfacciandosi con vie di controllo qualità come la risposta alle proteine non correttamente ripiegate (unfolded protein response, UPR) e la degradazione di glicoproteine aberranti. Regolando lo smaltimento di proteine mal ripiegate o non assemblate, DERL1 influenza l’adattamento cellulare al carico secretorio, allo squilibrio redox e allo stress proteotossico. Un’alterazione dell’espressione di DERL1 è stata riportata in molteplici contesti patologici caratterizzati da stress cronico del RE e da un’omeostasi proteica deregolata, a supporto della sua utilità come nodo meccanicistico per studiare la segnalazione di stress e la clearance legata al proteasoma.

Derlin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DERL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Derlin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DERL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DERL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Derlin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DERL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Derlin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Derlin-1 nelle cellule tumorali con espressione di DERL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.