Delta-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401271-ACT

O DLL4 humano codifica a Delta-4, um ligante de Notch associado à membrana que medeia sinalização juxtácrina para regular a especificação arterial, as decisões entre células “tip” e “stalk” e a morfogênese do ramificação vascular. As interações DLL4–NOTCH coordenam programas transcricionais que acoplam o brotamento angiogênico à quiescência endotelial, integrando sinais de VEGF e de outros fatores do microambiente. A expressão desregulada de DLL4 ou um desequilíbrio na sua sinalização está associado a remodelamento vascular anormal e a estados de perfusão alterados observados na angiogênese tumoral e em outras patologias relacionadas ao sistema vascular. Como um nó da via, o DLL4 é frequentemente estudado pelos seus efeitos na diferenciação endotelial, na comunicação célula–célula e no controle dependente do contexto da proliferação.

Delta-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DLL4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Delta-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DLL4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DLL4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Delta-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DLL4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Delta-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Delta-4 em células tumorais com expressão de DLL4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.