DDX29 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405089-ACT

DHX29 (DDX29) codifica um fator humano semelhante a uma helicase de RNA do tipo DEAH-box, implicado na iniciação da tradução, em que favorece um escaneamento ribossômico eficiente e a seleção do códon de iniciação em mRNAs com estruturas secundárias. Ao modular o comportamento do complexo 43S de pré-iniciação, a DDX29 contribui para a homeostase do proteoma e pode influenciar programas celulares de adaptação ao estresse acoplados ao metabolismo de RNA. A perturbação de fatores de iniciação da tradução e de redes de helicases de RNA é frequentemente associada a alterações no controle do crescimento e a respostas a estresse proteotóxico, tornando a DHX29 um nó relevante para estudos mecanísticos em reprogramação translacional associada a doenças. A biologia da DHX29 também é de interesse em contextos em que mudanças na estrutura do mRNA ou na eficiência de iniciação remodelam a expressão de reguladores de ciclo celular, diferenciação e vias de estresse.

DDX29 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DHX29 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DDX29 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DHX29 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DHX29, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DDX29. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DHX29 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DDX29 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DDX29 em células tumorais com expressão de DHX29 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.