DDIT3/CHOP/GADD153 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419970-ACT

Ddit3 codifica o fator de transcrição induzível por estresse DDIT3/CHOP/GADD153, um efetor central da resposta integrada ao estresse e da resposta a proteínas mal dobradas (UPR) desencadeada por estresse do retículo endoplasmático (RE). O CHOP forma heterodímeros com membros da família C/EBP para remodelar programas de expressão gênica que influenciam apoptose, autofagia, equilíbrio redox e controle do ciclo celular durante estresse proteotóxico e metabólico. Em células de camundongo, Ddit3 é comumente usado como um marcador molecular de estresse do RE a jusante da sinalização PERK–eIF2α–ATF4 e se conecta a disfunção mitocondrial e a vias inflamatórias. A atividade desregulada de Ddit3 tem sido implicada em modelos de doença metabólica, neurodegeneração, lesão tecidual e biologia tumoral, sustentando seu uso em estudos mecanísticos de adaptação ao estresse e de decisões de destino celular.

DDIT3/GADD153/CHOP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ddit3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DDIT3/GADD153/CHOP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ddit3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ddit3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DDIT3/GADD153/CHOP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ddit3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DDIT3/GADD153/CHOP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DDIT3/GADD153/CHOP em células tumorais com expressão de Ddit3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.