DDB1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419966-ACT

A DDB1 (damage specific DNA binding protein 1) de camundongo é um adaptador central do complexo de ubiquitina ligase E3 CUL4–DDB1, que coordena a degradação dependente de ubiquitina de proteínas regulatórias envolvidas na manutenção do genoma. Participa do reparo por excisão de nucleotídeos, do licenciamento da replicação do DNA, da remodelação da cromatina e da progressão do ciclo celular ao montar receptores de substrato e modular a proteostase após estresse genotóxico. Por meio dessas vias, a DDB1 influencia respostas ao estresse replicativo e programas transcricionais ligados à proliferação e diferenciação celulares. A desregulação da sinalização de ubiquitina associada à DDB1 e dos circuitos de reparo de DNA é frequentemente estudada em modelos de instabilidade genômica e em biologia relevante para o câncer.

DDB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ddb1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DDB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ddb1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ddb1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DDB1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ddb1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DDB1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DDB1 em células tumorais com expressão de Ddb1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.