DARPP-32 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400430-ACT

PPP1R1B codifica a DARPP-32 (fosfoproteína de 32 kDa regulada por dopamina e por AMPc), um integrador central da sinalização dopaminérgica e glutamatérgica em neurônios. Quando fosforilada pela PKA, a DARPP-32 inibe a fosfatase de proteínas 1, modulando assim estados de fosforilação a jusante que moldam a plasticidade sináptica, respostas transcricionais e a excitabilidade neuronal. Essa regulação conecta o PPP1R1B à sinalização de AMPc/PKA, a vias dependentes de cálcio e a redes de fosforilação acionadas por receptores em neurônios espinhosos médios do estriado. Alterações na expressão ou na fosforilação da DARPP-32 são frequentemente estudadas no contexto de mecanismos de doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas, bem como de mudanças na transdução de sinal na biologia tumoral.

DARPP-32 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPP1R1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DARPP-32 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPP1R1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPP1R1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DARPP-32. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPP1R1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DARPP-32 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DARPP-32 em células tumorais com expressão de PPP1R1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.