Cytokeratin 3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402161-ACT

KRT3 codifica a citoqueratina 3, uma proteína de filamento intermediário do tipo II que se associa à queratina 12 para formar a rede citoesquelética central das células epiteliais corneanas diferenciadas. A citoqueratina 3 contribui para a estabilidade mecânica, a forma celular e a resistência ao estresse de cisalhamento ao integrar-se na montagem de filamentos intermediários e ao coordenar-se com estruturas associadas a desmossomos e hemidesmossomos. Sua expressão reflete programas de maturação epitelial e está ligada a processos como manutenção da barreira, reparo de feridas e remodelamento epitelial. Padrões desregulados de expressão de queratinas, incluindo alterações em KRT3, são usados para estudar estados de diferenciação do epitélio corneano e patologias da superfície ocular em modelos experimentais.

Cytokeratin 3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KRT3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cytokeratin 3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KRT3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KRT3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cytokeratin 3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KRT3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cytokeratin 3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cytokeratin 3 em células tumorais com expressão de KRT3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.