Cytokeratin 3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402161-ACT

KRT3 codifica la citocheratina 3, una proteina dei filamenti intermedi di tipo II che si associa alla cheratina 12 per formare la rete citoscheletrica centrale delle cellule epiteliali corneali differenziate. La citocheratina 3 contribuisce alla stabilità meccanica, alla forma cellulare e alla resistenza alle forze di taglio integrandosi nell’assemblaggio dei filamenti intermedi e coordinandosi con strutture associate a desmosomi ed emidesmosomi. La sua espressione rispecchia i programmi di maturazione dell’epitelio ed è collegata a processi quali il mantenimento della barriera, la riparazione delle ferite e il rimodellamento epiteliale. Pattern deregolati di espressione delle cheratine, inclusa un’alterazione di KRT3, vengono utilizzati per studiare gli stati di differenziazione dell’epitelio corneale e la patologia della superficie oculare in modelli sperimentali.

Cytokeratin 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cytokeratin 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cytokeratin 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cytokeratin 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cytokeratin 3 nelle cellule tumorali con espressione di KRT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.