Cytokeratin 19 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400281-ACT

KRT19 codifica a citoqueratina 19, uma proteína de filamento intermediário do tipo I que contribui para a integridade estrutural e a resistência mecânica de epitélios simples. A citoqueratina 19 participa da organização do citoesqueleto, da dinâmica de adesão célula–célula e das respostas epiteliais ao estresse, e sua expressão é comumente usada para definir estados de linhagem epitelial e programas de diferenciação. Padrões alterados de expressão de KRT19 estão associados à remodelação epitelial, a respostas inflamatórias a lesões e à transformação oncogênica, nas quais mudanças na composição dos filamentos acompanham alterações na proliferação e na motilidade. Como marcador de linhagem e de estado, a citoqueratina 19 é frequentemente estudada em vias ligadas à plasticidade epitelial, à sinalização associada ao citoesqueleto e à heterogeneidade tumoral.

Cytokeratin 19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KRT19 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cytokeratin 19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KRT19 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KRT19, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cytokeratin 19. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KRT19 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cytokeratin 19 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cytokeratin 19 em células tumorais com expressão de KRT19 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.