Cytokeratin 10 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400193-ACT

KRT10 codifica a citoqueratina 10, uma proteína de filamento intermediário do tipo I que se emparelha com a queratina 1 para formar a rede de queratinas suprabasais em queratinócitos epidérmicos em diferenciação. Esse arcabouço do citoesqueleto sustenta a resistência mecânica, conecta-se à adesão desmossomal e coordena programas de diferenciação terminal, incluindo a estratificação e a formação do envelope córneo. A expressão de KRT10 está intimamente ligada à maturação dos queratinócitos e ao controle transcricional específico do tecido, e perturbações na homeostase dos filamentos de queratina podem alterar a integridade epitelial e a sinalização de estresse. Alterações genéticas e de expressão envolvendo KRT10 estão implicadas em distúrbios de diferenciação epidérmica e hiperqueratose, oferecendo um eixo útil para estudar a biologia da barreira cutânea e mecanismos de doença epitelial.

Cytokeratin 10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KRT10 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cytokeratin 10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KRT10 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KRT10, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cytokeratin 10. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KRT10 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cytokeratin 10 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cytokeratin 10 em células tumorais com expressão de KRT10 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.