cytohesin-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403025-ACT

O CYTH2 humano codifica a citoesina-2, um fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF) para ARF que ativa pequenas GTPases ARF para coordenar o tráfego de membranas, a sinalização dependente de fosfoinositídeos e a remodelação do citoesqueleto de actina. Por meio do seu domínio catalítico Sec7 e do recrutamento à membrana mediado por domínio de homologia à plecstrina, a citoesina-2 sustenta a reciclagem de receptores, a adesão dependente de integrinas e vias a jusante, incluindo PI3K/AKT e MAPK, que moldam a motilidade celular e as respostas de sobrevivência. A atividade de CYTH2 tem sido estudada em contextos de ativação de células imunes e sinalização inflamatória, e a disfunção do eixo citoesina/ARF é frequentemente investigada por sua contribuição para migração aberrante e controle de crescimento alterado em fenótipos celulares associados a doenças. Essas propriedades tornam o CYTH2 um alvo útil para dissecar a regulação endocítica e a plasticidade de redes de sinalização na biologia celular mecanística.

cytohesin-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CYTH2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cytohesin-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CYTH2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CYTH2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cytohesin-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CYTH2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cytohesin-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cytohesin-2 em células tumorais com expressão de CYTH2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.