cyt19 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404196-ACT

O AS3MT humano codifica a cyt19, uma metiltransferase de arsenito que catalisa a metilação dependente de S-adenosilmetionina do arsênio inorgânico em metabólitos mono- e dimetilados, moldando a biotransformação celular do arsênio e a homeostase redox. Essa atividade se cruza com o metabolismo de um carbono e com vias de desintoxicação ligadas à glutationa, influenciando a sinalização de estresse oxidativo e a função mitocondrial sob exposição a metaloides. Variações genéticas e alterações na expressão de AS3MT estão associadas a diferenças interindividuais no metabolismo do arsênio e na suscetibilidade a toxicidades relacionadas ao arsênio, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de respostas ao estresse ambiental e de regulação metabólica. Assim, AS3MT/cyt19 é comumente investigado em modelos de biologia de hepatócitos, rim e sistema vascular, nos quais o processamento de xenobióticos e a adaptação ao estresse são variáveis experimentais centrais.

cyt19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AS3MT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cyt19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AS3MT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AS3MT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cyt19. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AS3MT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cyt19 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cyt19 em células tumorais com expressão de AS3MT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.