cystatin A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416374-ACT

O CSTA humano codifica a cistatina A, uma cistatina intracelular do tipo I que inibe proteases cisteínicas do tipo papaína, como as catepsinas B, H e L, modulando assim a proteólise, o processamento de antígenos e a homeostase celular associada à barreira. Ao restringir a atividade de proteases lisossomais e citosólicas, a cistatina A contribui para a regulação da diferenciação de queratinócitos, da integridade epitelial e de respostas ao estresse ligadas ao equilíbrio entre proteases e antiproteases. A expressão desregulada de CSTA tem sido associada a condições inflamatórias da pele e ao remodelamento epitelial, e alterações na dinâmica cistatina–catepsina são frequentemente exploradas em estudos de invasão tumoral, sinalização imune e renovação da matriz extracelular. Como resultado, o CSTA serve como um ponto útil para dissecar vias controladas por proteases que influenciam a adesão celular, a migração e a morte celular programada.

cystatin A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CSTA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cystatin A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CSTA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CSTA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cystatin A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CSTA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cystatin A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cystatin A em células tumorais com expressão de CSTA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.