cyclin T1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400623-ACT

CCNT1 codifica a ciclina T1, o parceiro regulador da CDK9 no complexo fator positivo de elongação da transcrição b (P-TEFb), que estimula a liberação da pausa da RNA polimerase II ao fosforilar o CTD e fatores de elongação negativos. Por meio do controle da elongação transcricional, a ciclina T1 influencia a progressão do ciclo celular, as respostas a danos no DNA e programas de diferenciação, além de ser um fator central do hospedeiro cooptado pela Tat do HIV-1 para aumentar a transcrição viral. Alterações na atividade do P-TEFb e na disponibilidade de ciclina T1 têm sido associadas a redes transcricionais desreguladas observadas na biologia do câncer e em contextos de sinalização inflamatória. Assim, o CCNT1 é amplamente estudado em vias que governam o controle transcricional, a regulação associada à cromatina e a expressão gênica responsiva ao estresse.

cyclin T1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCNT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cyclin T1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCNT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCNT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cyclin T1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCNT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cyclin T1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cyclin T1 em células tumorais com expressão de CCNT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.