CUL-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416925-ACT

O gene humano CUL3 codifica a cullina-3 (CUL-3), um arcabouço central dos complexos ligase E3 de ubiquitina CRL3, que conectam adaptadores de substrato com domínio BTB à RBX1 para transferência de ubiquitina e degradação pelo proteassoma. Por meio da renovação seletiva de proteínas regulatórias, a CUL-3 influencia a proteostase, a progressão do ciclo celular, as respostas ao estresse oxidativo e a organização do citoesqueleto, incluindo vias ligadas à sinalização KEAP1–NRF2. A atividade CRL3 desregulada pode comprometer a homeostase redox e o controle de checkpoints, tornando o CUL3 um alvo frequentemente estudado na biologia do câncer e em programas de adaptação ao estresse. Alterações em redes de ubiquitinação dependentes de CUL3 também são usadas para modelar mecanismos relevantes para fenótipos do neurodesenvolvimento e cardiovasculares em sistemas celulares.

CUL-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CUL3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CUL-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CUL3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CUL3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CUL-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CUL3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CUL-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CUL-3 em células tumorais com expressão de CUL3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.