CTDSPL2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m2): sc-435953-ACT-2

O gene murino Ctdspl2 codifica a CTDSPL2, uma fosfatase dependente de Mg2+ da família das desalogeno-hidrolases de haloácidos (HAD) que contribui para a desfosforilação de fosfoserina/fosfotreonina e para o controle transcricional por meio da regulação da dinâmica de fosforilação do domínio C-terminal da RNA polimerase II. A CTDSPL2 está associada a transições de estado celular ao modular a sinalização dependente de fosforilação e programas de expressão gênica que influenciam a progressão do ciclo celular, a diferenciação e o comprometimento de linhagem, integrando-se a vias que governam a regulação transcricional associada à cromatina. A desregulação da atividade de fosfatases do CTD e de circuitos transcricionais relacionados tem sido associada a fenótipos oncogênicos e do desenvolvimento, tornando Ctdspl2 um locus útil para dissecar redes transcricionais impulsionadas por fosforilação em modelos de doença. A edição gênica de Ctdspl2 em células de camundongo dá suporte a estudos de genômica funcional do controle da fosforilação do CTD, das relações fosfatase-substrato e de alterações subsequentes no transcriptoma relevantes para contextos de proliferação e diferenciação.

CTDSPL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ctdspl2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CTDSPL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ctdspl2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ctdspl2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CTDSPL2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ctdspl2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CTDSPL2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CTDSPL2 em células tumorais com expressão de Ctdspl2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.