Csk Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400992-ACT

O CSK humano codifica a Csk, uma tirosina quinase citosólica não receptora que regula negativamente as quinases da família Src ao fosforilar a tirosina inibitória C-terminal dessas proteínas, restringindo assim a sinalização proveniente de receptores imunes, integrinas e vias de fatores de crescimento. Por meio desse papel de “porteiro”, a Csk molda programas a jusante de MAPK/ERK, PI3K–AKT e de remodelamento do citoesqueleto, que influenciam adesão, migração e os limiares de ativação celular. Alterações na atividade ou na regulação de CSK têm sido associadas a sinalização imune desregulada e fenótipos inflamatórios, e o gene é frequentemente estudado em contextos nos quais redes de fosforilação conduzidas por Src contribuem para biologia aberrante de proliferação e invasão. Como modulador central da sinalização das quinases da família Src, a Csk é relevante para análises em nível de sistema de circuitos de fosforilação em tirosina e sua associação com estados de sinalização relacionados a autoimunidade e câncer.

Csk O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CSK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Csk O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CSK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CSK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Csk. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CSK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Csk no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Csk em células tumorais com expressão de CSK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.