CSA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403428-ACT

ERCC8 codifica a proteína A da síndrome de Cockayne (CSA), um fator com repetições WD40 que atua como componente de reconhecimento de substrato do complexo ligase E3 de ubiquitina CRL4CSA. A CSA é central para o reparo por excisão de nucleotídeos acoplado à transcrição, coordenando o reconhecimento de lesões em locais onde a RNA polimerase II fica estagnada e promovendo a remodelação dependente de ubiquitina da maquinaria de reparo e de transcrição para restaurar a expressão gênica após danos induzidos por UV. Por meio de interações com CSB/ERCC6 e outros fatores de NER, a CSA ajuda a manter a estabilidade do genoma e favorece a recuperação da transcrição após estresse genotóxico. Variantes patogênicas em ERCC8 estão associadas à síndrome de Cockayne e a fenótipos relacionados de sensibilidade a UV, alterações no neurodesenvolvimento e envelhecimento precoce, tornando a regulação de CSA relevante para estudos sobre capacidade de reparo de DNA e sinalização de resposta ao estresse.

CSA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ERCC8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CSA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ERCC8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ERCC8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CSA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ERCC8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CSA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CSA em células tumorais com expressão de ERCC8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.