CRTAP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405828-ACT

CRTAP (proteína associada à cartilagem) é um componente residente do retículo endoplasmático do complexo de 3-hidroxilação de prolina, que atua em conjunto com P3H1/LEPRE1 e PPIB/ciclofilina B para modificar e funcionar como chaperona de colágenos fibrilares recém-sintetizados. Ao regular o processamento pós-traducional do colágeno, a CRTAP sustenta o dobramento correto da tripla hélice, a secreção e a montagem da matriz extracelular, conectando-a às vias de biossíntese de colágeno e de proteostase no RE. A disrupção ou redução da função de CRTAP perturba a homeostase do tecido conjuntivo e está implicada em displasias esqueléticas hereditárias, incluindo formas recessivas de osteogênese imperfeita. Por isso, a CRTAP é amplamente estudada em biologia da matriz, na diferenciação de osteoblastos e condrócitos e nos mecanismos de estresse do RE associados à maturação anormal do colágeno.

CRTAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRTAP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CRTAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRTAP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRTAP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CRTAP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRTAP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CRTAP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CRTAP em células tumorais com expressão de CRTAP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.