CRLR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401631-ACT

CALCRL codifica o receptor semelhante ao receptor de calcitonina (CRLR), um GPCR de classe B que forma complexos receptores funcionais com proteínas RAMP para mediar a sinalização de peptídeos vasoativos como o CGRP e a adrenomedulina. Após a ligação do ligante, o CRLR ativa vias acopladas à proteína G, incluindo cAMP/PKA, e programas transcricionais a jusante que regulam o tônus vascular, a função de barreira endotelial, a biologia linfática e respostas inflamatórias. A atividade do CRLR cruza-se com redes angiogênicas e de resposta ao estresse, influenciando processos como vasodilatação, homeostase de fluidos e sinalização neurovascular. A expressão ou sinalização desregulada de CALCRL tem sido associada a fenótipos cardiovasculares e linfáticos e foi estudada em contextos de vias neurovasculares relacionadas à enxaqueca, remodelamento vascular pulmonar e angiogênese associada a tumores.

CRLR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CALCRL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CRLR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CALCRL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CALCRL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CRLR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CALCRL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CRLR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CRLR em células tumorais com expressão de CALCRL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.