Plásmido CRISPR de Activación (h) CRF: sc-400770-ACT

El CRH humano codifica la hormona liberadora de corticotropina (CRF), un neuropéptido que inicia el eje hipotálamo–hipófisis–suprarrenal (HPA) al estimular la secreción de ACTH por los corticotrofos hipofisarios y coordinar las respuestas sistémicas al estrés. La CRF señaliza principalmente a través de CRHR1/CRHR2, activando las vías Gs–adenilil ciclasa–cAMP–PKA y programas transcripcionales posteriores que modulan procesos neuroendocrinos, inmunitarios y autonómicos. En el cerebro y en tejidos periféricos, CRH/CRF contribuye a la regulación de conductas tipo ansioso, el estado de alerta, el apetito y el tono inflamatorio mediante circuitos neuroendocrinos integrados. La desregulación de la expresión y la señalización de CRH se ha asociado con fenotipos neuropsiquiátricos relacionados con el estrés y con alteraciones de la homeostasis endocrina, lo que la convierte en una diana útil para estudios mecanísticos de los circuitos del estrés y de redes génicas reguladas por hormonas.

CRF El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CRH sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CRF El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CRH en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CRH, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CRF. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CRH y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CRF en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CRF en células tumorales con expresión de CRH silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.