Plásmido CRISPR de Activación (h) CRF-BP: sc-403849-ACT

CRHBP codifica la proteína de unión al factor liberador de corticotropina (CRF-BP), una glucoproteína secretada que se une a péptidos de la familia del CRF y modula su biodisponibilidad, la interacción con los receptores y el aclaramiento de los péptidos. Al moldear la señalización del CRF, la CRF-BP influye en la regulación del eje hipotalámico-hipofisario-adrenal (HHA), en las respuestas neuroendocrinas al estrés y en los programas transcripcionales posteriores dependientes de cAMP/PKA. La expresión de CRHBP y la actividad de la vía CRF/urocortina se han relacionado con fenotipos neuropsiquiátricos asociados al estrés, la señalización inflamatoria y la homeostasis metabólica. En sistemas experimentales, la CRF-BP ofrece una herramienta mecanística para estudiar el amortiguamiento del ligando y la señalización del receptor de CRF dependiente del contexto en tipos celulares neuronales y periféricos.

CRF-BP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CRHBP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CRF-BP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CRHBP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CRHBP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CRF-BP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CRHBP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CRF-BP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CRF-BP en células tumorales con expresión de CRHBP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.