COL7A1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401235-ACT

O COL7A1 codifica o colágeno tipo VII, um componente-chave da matriz extracelular que forma fibrilas de ancoragem que conectam a membrana basal da epiderme à derme subjacente. Ao estabilizar a junção dermoepidérmica, o COL7A1 sustenta a integridade tecidual, a mecanotransdução e programas de reparo de feridas por meio da organização da matriz e de vias de adesão célula–matriz. Alterações na expressão ou na função do COL7A1 desorganizam a arquitetura da membrana basal e estão fortemente associadas a fenótipos de fragilidade cutânea, incluindo a epidermólise bolhosa distrófica, além de contribuírem para reepitelização prejudicada e remodelamento fibrótico. Assim, o COL7A1 é amplamente estudado no crosstalk entre queratinócitos e fibroblastos, na montagem da matriz extracelular e na biologia da barreira epitelial.

COL7A1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de COL7A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

COL7A1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus COL7A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição COL7A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de COL7A1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus COL7A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de COL7A1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via COL7A1 em células tumorais com expressão de COL7A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.