Plásmido CRISPR de Activación (h) COL5A1: sc-401579-ACT

COL5A1 codifica la cadena pro‑α1(V) del colágeno tipo V, un colágeno fibrilar que se coensambla con el colágeno tipo I para regular la fibrilogénesis del colágeno y la arquitectura de la matriz extracelular (MEC). Al controlar la nucleación y el diámetro de las fibras de colágeno, COL5A1 influye en la resistencia a la tracción del tejido conectivo, la adhesión célula–matriz y los programas de mecanotransducción que moldean el desarrollo y la remodelación tisulares. La organización de la MEC asociada a COL5A1 se entrecruza con vías que gobiernan la reparación de heridas y la remodelación del estroma, incluidas la señalización de integrinas/FAK y la deposición de matriz vinculada a TGF‑β. Las alteraciones genéticas de COL5A1 se asocian a trastornos hereditarios del tejido conectivo, y su expresión alterada se estudia con frecuencia en la fibrosis y en la biología del microambiente tumoral.

COL5A1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de COL5A1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

COL5A1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus COL5A1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional COL5A1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de COL5A1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo COL5A1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de COL5A1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía COL5A1 en células tumorales con expresión de COL5A1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.