Plásmido CRISPR de Activación (h) COL4A5: sc-401199-ACT

COL4A5 codifica la cadena α5 del colágeno tipo IV, un componente estructural central de las membranas basales que se ensambla en redes heterotriméricas que sostienen la arquitectura tisular y la filtración selectiva. En los glomérulos renales, la cóclea y los tejidos oculares, los andamiajes de colágeno IV que contienen COL4A5 influyen en la adhesión célula–matriz, la mecanotransducción y la organización de la matriz extracelular, integrándose con vías mediadas por integrinas, complejos de adhesión focal y enzimas de remodelación de la matriz. La alteración de la expresión de COL4A5 o de la integridad de la red perturba la estabilidad y la permeabilidad de la membrana basal, contribuyendo a nefropatías hereditarias y a fenotipos sensoriales relacionados. Por ello, COL4A5 se estudia ampliamente en la biología epitelial y endotelial, la dinámica de la matriz extracelular y modelos de disfunción de la membrana basal.

COL4A5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de COL4A5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

COL4A5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus COL4A5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional COL4A5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de COL4A5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo COL4A5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de COL4A5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía COL4A5 en células tumorales con expresión de COL4A5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.