Claspin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404153-ACT

O CLSPN humano codifica a Claspina, um mediador do checkpoint de replicação que conecta a sinalização de ATR à ativação de CHK1 em resposta ao estresse replicativo e a danos no DNA. A Claspina coordena a estabilização de forquilhas de replicação estagnadas, a imposição do checkpoint da fase S e o timing de disparo das origens de replicação para preservar a integridade do genoma. Sua atividade se cruza com as vias de replicação do DNA, resposta a dano no DNA e controle do ciclo celular, e alterações na sinalização de checkpoints têm sido associadas à instabilidade genômica observada em diversos cânceres e em distúrbios hereditários de manutenção do genoma. Portanto, o CLSPN é rotineiramente estudado em mecanismos de tolerância ao estresse replicativo, fragilidade cromossômica e sensibilidade a perturbações genotóxicas.

Claspin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CLSPN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Claspin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CLSPN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CLSPN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Claspin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CLSPN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Claspin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Claspin em células tumorais com expressão de CLSPN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.