Chx10 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401103-ACT

VSX2 (Chx10) codifica um fator de transcrição homeobox do tipo paired-like que regula a proliferação de células progenitoras da retina, a especificação do destino neuronal e a diferenciação de interneurônios bipolares durante o desenvolvimento do olho humano. O Chx10 integra redes regulatórias gênicas do desenvolvimento ao se ligar a elementos cis-regulatórios e coordenar programas transcricionais que influenciam a progressão do ciclo celular e o comprometimento de linhagem na neurorretina. A atividade alterada de VSX2 está associada a malformações oculares congênitas e a defeitos do neurodesenvolvimento que afetam a estrutura e a função da retina, tornando-o um nó relevante para estudar mecanismos do desenvolvimento ocular e da identidade celular retiniana. In vitro, a modulação de VSX2 é comumente usada para investigar circuitos transcricionais em organoides de retina e em linhagens retinianas derivadas de células-tronco.

Chx10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VSX2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Chx10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VSX2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VSX2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Chx10. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VSX2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Chx10 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Chx10 em células tumorais com expressão de VSX2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.