CHIP/STUB1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400815-ACT

STUB1 codifica a ligase E3 de ubiquitina CHIP, uma co-chaperona que acopla o reconhecimento de clientes por HSP70/HSP90 à renovação proteica dependente de ubiquitina por meio dos seus domínios de repetição tetratricopeptídica (TPR) e U-box. CHIP/STUB1 regula a proteostase ao coordenar o controle de qualidade de proteínas, decisões de refoldagem mediada por chaperonas e a degradação via sistema ubiquitina–proteassoma, com efeitos a jusante nas respostas celulares ao estresse e na homeostase mitocondrial e do retículo endoplasmático (RE). Por meio desses processos, STUB1 influencia vias ligadas à agregação proteica e à manutenção neuronal, e alterações na atividade de CHIP/STUB1 têm sido associadas a fenótipos de neurodegeneração e a mecanismos de doença relacionados à ataxia. Seu papel central no controle da carga de proteínas mal dobradas torna STUB1 um alvo útil para estudar sinalização de estresse e estabilidade do proteoma em modelos de células humanas.

CHIP/STUB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de STUB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CHIP/STUB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus STUB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição STUB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CHIP/STUB1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus STUB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CHIP/STUB1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CHIP/STUB1 em células tumorais com expressão de STUB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.