Cdt1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401014-ACT

O gene humano **CDT1** codifica a Cdt1, um fator de licenciamento da replicação do DNA que carrega a helicase **MCM2–7** nas origens de replicação durante a mitose tardia e a fase G1, para garantir a entrada oportuna na fase S. A atividade de Cdt1 é rigidamente regulada por fosforilação dependente de CDK, ligação à geminina e proteólise mediada por ubiquitina pelas vias **CRL4^Cdt2** e **SCF^Skp2**, a fim de prevenir a rereplicação e preservar a estabilidade do genoma. A desregulação de **CDT1** pode induzir estresse replicativo, disparo aberrante de origens e sinalização de dano ao DNA, processos frequentemente associados à instabilidade cromossômica no câncer e em outras doenças proliferativas. Como componente central da rede de licenciamento de origens, Cdt1 é amplamente estudada no controle do ciclo celular, nas respostas de checkpoint e no reparo do DNA acoplado à replicação.

Cdt1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cdt1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cdt1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cdt1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cdt1 em células tumorais com expressão de CDT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.