CD39L4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410720-ACT

O gene humano ENTPD5 codifica a CD39L4, uma ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolase localizada no retículo endoplasmático, que hidrolisa UDP e GDP em monofosfatos, contribuindo para a homeostase de açúcares nucleotídicos e para o controle de qualidade de glicoproteínas. Ao sustentar o ciclo de dobramento dependente de UDP-glicose mediado por calnexina/calreticulina, a CD39L4 influencia o processamento de proteínas no RE, a N-glicosilação e programas de proteostase ligados à secreção e à maturação de receptores de membrana. A atividade de ENTPD5 se conecta à sinalização de estresse do RE e ao remodelamento metabólico por meio de efeitos sobre a demanda de dobramento proteico e o tráfego dependente de glicanos. A expressão desregulada de ENTPD5 tem sido associada a fenótipos alterados de glicosilação e a vias relacionadas à proliferação na biologia do câncer, tornando-o relevante para estudos de homeostase do RE e de redes de sinalização oncogênicas.

CD39L4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ENTPD5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CD39L4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ENTPD5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ENTPD5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CD39L4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ENTPD5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CD39L4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CD39L4 em células tumorais com expressão de ENTPD5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.