CCK-BR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401867-ACT

O CCKBR humano codifica o receptor de colecistocinina B (CCK-BR), um GPCR de classe A ativado pelos peptídeos gastrina e colecistocinina, que se acopla principalmente a Gq/11 para estimular a fosfolipase C, a sinalização IP3/DAG, o fluxo intracelular de Ca2+ e programas transcricionais dependentes de PKC. Os efeitos a jusante incluem a modulação da sinalização MAPK/ERK, da dinâmica do citoesqueleto e de respostas secretórias e proliferativas em contextos gastrointestinais e neuronais. A atividade do CCKBR integra sinais neuroendócrinos com a homeostase epitelial e a excitabilidade, e a desregulação da sinalização ou da expressão do receptor tem sido estudada em relação a sinalização de crescimento aberrante e remodelamento associado à inflamação. Como receptor de membrana com farmacologia ligante–receptor bem definida, o CCK-BR também é usado para investigar dessensibilização de GPCR, tráfego intracelular e viés de vias de segundos mensageiros.

CCK-BR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCKBR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CCK-BR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCKBR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCKBR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CCK-BR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCKBR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CCK-BR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CCK-BR em células tumorais com expressão de CCKBR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.