Cbl-b Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400828-ACT

O CBLB humano codifica a Cbl-b, uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING que atenua a sinalização proximal aos receptores ao promover a ubiquitinação e a degradação/reciclagem de intermediários-chave de sinalização. A Cbl-b ajuda a definir limiares de ativação em células imunes, restringindo vias a jusante do receptor de célula T (TCR) e de receptores coestimuladores, e influenciando as saídas de sinalização PI3K–AKT, MAPK e NF-κB. Por meio dessas funções, contribui para a homeostase e a tolerância imunológicas, e sua desregulação está associada a respostas inflamatórias alteradas e a fenótipos de doenças imunomediadas. Além disso, a sinalização de ubiquitina dependente de Cbl-b pode afetar a remodelação do citoesqueleto e o tráfego de receptores, aspectos relevantes para a migração celular e estados de ativação.

Cbl-b O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CBLB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cbl-b O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CBLB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CBLB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cbl-b. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CBLB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cbl-b no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cbl-b em células tumorais com expressão de CBLB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.