CAT-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403628-ACT

SLC7A1 umano codifica il trasportatore 1 di amminoacidi cationici (CAT-1), un trasportatore di membrana plasmatica ad alta affinità che media l’assorbimento di L-arginina, L-lisina e L-ornitina. Regolando la disponibilità intracellulare di arginina, CAT-1 influenza la sintesi di ossido nitrico, la biosintesi delle poliammine e programmi più ampi di “amino acid sensing” che modellano la crescita cellulare, l’equilibrio redox e la segnalazione immunitaria. L’attività di CAT-1 interseca le vie endoteliali e infiammatorie fornendo substrati per la segnalazione dipendente dalla NOS e per il metabolismo dell’arginina. Un’espressione o una capacità di trasporto di SLC7A1 deregolate sono state associate a disfunzione vascolare, fenotipi cardiometabolici e stati proliferativi alterati, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sul trasporto di amminoacidi e sul crosstalk della segnalazione.

CAT-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC7A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CAT-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC7A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC7A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CAT-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC7A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CAT-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CAT-1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC7A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.