Calpastatin Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419474-ACT

O gene Cast em camundongos codifica a calpastatina, o inibidor endógeno das proteases calpaínas dependentes de cálcio, que limita a proteólise restrita de substratos do citoesqueleto e de sinalização. Ao ajustar a atividade das calpaínas, a calpastatina ajuda a regular a remodelação do citoesqueleto, a renovação das adesões focais, o tráfego de membranas e a apoptose, com efeitos a jusante sobre a sinalização inflamatória e as respostas ao estresse. O equilíbrio CAST–calpaína é amplamente relevante para a integridade tecidual no músculo e no sistema nervoso, e sua desregulação tem sido associada na literatura a mecanismos subjacentes a miopatias, neurodegeneração e alterações na ativação de células imunes. Em modelos celulares e animais, a modulação da expressão de Cast é usada para dissecar programas de remodelação dirigidos por proteases e redes de sinalização dependentes de cálcio.

Calpastatin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Cast sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Calpastatin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Cast em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Cast, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Calpastatin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Cast nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Calpastatin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Calpastatin em células tumorais com expressão de Cast silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.