Calnexin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400154-ACT

O CANX humano codifica a calnexina, uma chaperona lectina de membrana do retículo endoplasmático (RE) que reconhece glicanos N-ligados monoglicosilados e promove o dobramento produtivo e o controle de qualidade de glicoproteínas nascentes. A calnexina atua no ciclo calnexina/calreticulina com a ERp57 e enzimas de processamento de glicoproteínas para coordenar a formação de pontes dissulfeto, a retenção no RE e a degradação associada ao RE (ERAD) de substratos mal dobrados. Por seu papel central na proteostase, o CANX se relaciona com a sinalização da resposta a proteínas mal dobradas, a homeostase de cálcio no RE e a regulação do fluxo da via secretória. Alterações na capacidade de dobramento dependente de calnexina têm sido associadas a fenótipos de estresse celular e a mecanismos relevantes para doenças que envolvem mau dobramento proteico e tráfego aberrante.

Calnexin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CANX sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Calnexin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CANX em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CANX, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Calnexin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CANX nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Calnexin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Calnexin em células tumorais com expressão de CANX silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.