BSPII Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402368-ACT

IBSP codifica a sialoproteína óssea II (BSPII), uma glicoproteína secretada da matriz extracelular, altamente ácida, enriquecida em tecidos mineralizados. A BSPII liga-se à hidroxiapatita e interage com integrinas por meio de um motivo RGD, sustentando a adesão e migração celular e a comunicação entre osteoblastos e osteoclastos durante a deposição e a remodelação da matriz óssea. A expressão de IBSP é regulada por programas transcricionais osteogénicos e contribui para processos associados à biomineralização que se cruzam com vias de adesão focal e de organização da matriz extracelular. A desregulação da expressão de IBSP/BSPII tem sido associada a alterações na renovação óssea e é frequentemente utilizada como marcador em estudos de desenvolvimento esquelético, calcificação e interações entre tumores e o microambiente ósseo.

BSPII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de IBSP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BSPII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus IBSP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição IBSP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BSPII. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus IBSP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BSPII no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BSPII em células tumorais com expressão de IBSP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.