BRCA1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419362-ACT

O gene Brca1 de camundongo codifica a proteína supressora tumoral BRCA1, um regulador central da estabilidade genômica que coordena o reparo de quebras de dupla fita do DNA, a proteção da forquilha de replicação e o controle de checkpoints do ciclo celular. A BRCA1 atua na recombinação homóloga por meio de interações com parceiros como BARD1, PALB2 e RAD51, e modula a cromatina e a sinalização por ubiquitina nos locais de dano. Em células de mamíferos, a BRCA1 integra respostas ao dano no DNA dependentes de ATM/ATR com programas de transcrição e replicação para limitar a mutagênese. A disrupção ou a regulação alterada de vias ligadas à BRCA1 é amplamente utilizada como modelo para estudar mecanismos de instabilidade genômica, respostas ao estresse e defeitos de reparo de DNA relevantes para o câncer em pesquisa biomédica.

BRCA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Brca1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BRCA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Brca1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Brca1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BRCA1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Brca1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BRCA1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BRCA1 em células tumorais com expressão de Brca1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.