brachyury Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416539-ACT

O gene T humano codifica a braquiúria, um fator de transcrição da família T-box essencial para a especificação do mesoderma, a formação da notocorda e o desenvolvimento do eixo posterior. A braquiúria regula programas de linhagem ao se ligar a motivos T-box e ao coordenar redes transcricionais que se articulam com processos associados à EMT, migração celular e vias de padronização do desenvolvimento. Em contextos adultos, a expressão desregulada de T tem sido associada a estados de diferenciação alterados e à reprogramação transcricional observada em múltiplos tipos de tumor e no cordoma, nos quais a braquiúria é frequentemente estudada como marcador associado à linhagem e como fator indutor. Como regulador do desenvolvimento, a braquiúria oferece um ponto de investigação acessível para examinar circuitos de regulação gênica que controlam transições epitélio–mesenquimais e decisões de destino mesodérmico em modelos celulares humanos.

brachyury O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de T sem alterar a sequência de ADN subjacente.

brachyury O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus T em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição T, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de brachyury. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus T nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de brachyury no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via brachyury em células tumorais com expressão de T silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.