BLM hydrolase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404411-ACT

BLMH codifica a hidrolase de bleomicina, uma protease neutra de cisteína que participa da renovação intracelular de peptídeos e aminoácidos e contribui para a desintoxicação celular de compostos do tipo bleomicina. A enzima está envolvida em processos relacionados à proteostase por meio do processamento proteolítico de peptídeos bioativos e pode influenciar o equilíbrio redox ao modular a tiolactona da homocisteína e metabólitos relacionados. A atividade de BLMH cruza vias que afetam o controle de qualidade de proteínas e respostas ao estresse, vinculando sua expressão a fenótipos em células de rápida proliferação ou sob estresse metabólico. Alterações na regulação de BLMH têm sido associadas na literatura a contextos de neurodegeneração e câncer, sustentando seu uso como alvo para estudos mecanísticos da função de proteases e da resiliência celular.

BLM hydrolase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BLMH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BLM hydrolase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BLMH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BLMH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BLM hydrolase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BLMH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BLM hydrolase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BLM hydrolase em células tumorais com expressão de BLMH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.