BLM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400896-ACT

BLM codifica uma helicase de DNA da família RecQ que protege a estabilidade do genoma ao resolver estruturas anómalas de DNA durante a replicação e a recombinação. A BLM atua na reparação por recombinação homóloga, no reinício de forquilhas de replicação e na dissolução de junções duplas de Holliday em conjunto com o complexo TOP3A–RMI1/2, limitando assim as trocas entre cromátides‑irmãs e os rearranjos cromossómicos. Está integrada em redes de resposta a danos no DNA que envolvem a sinalização ATR/ATM e influencia o controlo dos checkpoints do ciclo celular sob stress replicativo. A perda da atividade de BLM associa-se a um aumento da carga mutacional e a fenótipos de instabilidade cromossómica característicos da síndrome de Bloom, sendo relevante para estudos de defeitos de manutenção do genoma associados ao cancro.

BLM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BLM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BLM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BLM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BLM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BLM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BLM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BLM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BLM em células tumorais com expressão de BLM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.