BECN1/Beclin-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425033-ACT

O gene Becn1 de camundongo codifica a BECN1/Beclin-1, um arcabouço central do complexo da fosfatidilinositol 3-quinase de classe III que regula o início da autofagia e a nucleação do autofagossomo. Por meio de interações com VPS34/PIK3C3, ATG14, UVRAG e proteínas da família BCL2, a BECN1 coordena o fluxo autofágico, o tráfego endolisossomal e as respostas celulares ao estresse por privação de nutrientes. A regulação da proteostase e do controle de qualidade de organelas mediada por BECN1 conecta essa via à neurodegeneração, à biologia de infecções, ao metabolismo de células tumorais e à sinalização inflamatória. Como um regulador nodal da autofagia, a BECN1/Beclin-1 é frequentemente estudada por seus efeitos em vias de sobrevivência, na homeostase mitocondrial e em programas transcricionais adaptativos ao estresse.

BECN1/Beclin-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Becn1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BECN1/Beclin-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Becn1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Becn1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BECN1/Beclin-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Becn1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BECN1/Beclin-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BECN1/Beclin-1 em células tumorais com expressão de Becn1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.