BBS8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404755-ACT

TTC8 codifica a BBS8, um componente central do complexo BBSome que coordena o tráfego de cargas para e a partir do cílio primário, sustentando a triagem de proteínas da membrana ciliar e processos ligados ao transporte intraflagelar. Por meio da regulação de sinalização dependente de cílios, incluindo Sonic hedgehog e o tráfego de GPCRs, a BBS8 ajuda a manter a polaridade celular e a sinalização sensorial em múltiplos tecidos. A ruptura genética ou a disfunção de BBS8 está associada à síndrome de Bardet–Biedl e a ciliopatias relacionadas, que se apresentam com fenótipos pleiotrópicos consistentes com comprometimento da estrutura e da sinalização ciliares. Em modelos celulares humanos, perturbar a expressão de TTC8 oferece uma abordagem viável para estudar a proteostase ciliar, o transporte vesicular e a reconfiguração de vias a jusante da sinalização ciliar alterada.

BBS8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TTC8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BBS8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TTC8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TTC8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BBS8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TTC8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BBS8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BBS8 em células tumorais com expressão de TTC8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.