ATGL Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401711-ACT

PNPLA2 codifica a lipase de triglicerídeos do tecido adiposo (ATGL), a enzima limitante da velocidade na hidrólise inicial do triacilglicerol armazenado em gotículas lipídicas citosólicas, gerando diacilglicerol e ácidos graxos livres para a β-oxidação mitocondrial e para o equilíbrio energético celular. A atividade da ATGL integra a dinâmica das gotículas lipídicas com redes de sinalização metabólica e de detecção de nutrientes, incluindo programas transcricionais conduzidos por PPAR e a regulação lipolítica por cofatores como ABHD5/CGI-58 e proteínas inibitórias como G0S2. A desregulação da expressão de PNPLA2 ou da função da ATGL perturba o turnover de triglicerídeos e o fluxo de ácidos graxos, contribuindo para alterações no armazenamento de lipídios, estresse lipotóxico e fenótipos metabólicos observados em tecido adiposo, fígado, coração e músculo esquelético. Como um nó central no catabolismo de lipídios neutros, PNPLA2/ATGL é amplamente estudado em modelos de doenças de armazenamento lipídico, vias relacionadas à resistência à insulina e respostas celulares à privação de nutrientes.

ATGL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PNPLA2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ATGL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PNPLA2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PNPLA2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ATGL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PNPLA2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ATGL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ATGL em células tumorais com expressão de PNPLA2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.